همیشه استفاده از یک مستر میکس one-step بهترین و سریع ترین راه برای دست یابی به نتیجه یک آزمایش PCR و یا Realtime PCR است. این روش سریع، ساده و کم خطا بوده و در یک RT-PCR تک مرحله ای مواد کمتری استفاده میشود. اما این روش محدودیت‌ها و کاربردهای ویژه خود را داشته و در برخی موارد بایستی روش سنتی را به روش تک مرحله ای ترجیه داد. در ادامه در مورد انواع استفاده‌های RT-PCR تک مرحله‌ای صحبت کرده و مروری بر کاربردهای مستر میکس one-step به خصوص در qPCR یا ریل تایم PCR صحبت خواهیم کرد.
واکنش PCR معکوس یا RT-PCR چیست ؟
روش PCR یا polymerase chain reaction یکی از تکنیک‌های تکثیر DNA است که توسط کری مولیس در اوایل قرن 18 میلادی کشف شد. امروزه روش PCR به یک روش استاندارد یا به عبارتی روش طلایی برای تکثیر و یا شناسایی اسیدهای نوکلئیک تبدیل شده است.
روش استاندارد کری مولیس در واقع روش تکثیر DNA در محیط آزمایشگاهی است اما وقتی با اسید نوکلئیک از نوع RNA مواجه هستیم نیاز داریم که ابتدا RNA را به DNA تبدیل کرده و سپس DNA حاصل شده را به روش PCR تکثیر کنیم. این کار توسط روشی به نام RT-PCR یا reverse transcription-PCR انجام میشود.
این آزمایش توسط آنزیمی به نام reverse transcriptase انجام میشود. محصول نهایی واکنش RT-PCR یا PCR معکوس، رشته DNA به نام cDNA یا DNA مکمل است که در مرحله PCR به عنوان تمپلیت مورد استفاده قرار میگیرد. این فرایند به صورت معمول توسط کیت سنتز cDNA انجام میشود.
روش One Step RT-PCR یا RT-PCR تک مرحله ای چیست ؟
در روش One Step RT-PCR دو مرحله تبدیل شدن RNA به DNA و تکثیر DNA در یک محیط یا تیوب واکنش، انجام میشود. به عبارتی ما دیگر cDNA حاصل از فعالیت آنزیم ریورس ترانسکریپتاز را برداشت نخواهیم کرد و مستقیما و به واسطه آنزیم پلیمراز موجود در همان تیوب واکنش PCR نیز انجام خواهد شد.
چرا از روش one-step RT-PCR استفاده میکنیم؟
روش RT-PCR تک مرحله ای ساده و سریع است و میزان کمتر پیپتینگ باعث میشود که خطای کمتری در این روش اتفاق بیافتد. استفاده از این روش تکرار پدیری را بالا برده و برای حجم‌های بالای نمونه بسیار کاربردی است.
علاوه بر این دو مرحله کار در یک دستگاه انجام شده و در مواردی که تعداد نمونه‌ها بالا است، نیاز ما را به دستگاه PCR کاهش میدهد.
منظور از RT-PCR دو مرحله ای چیست؟
در روش PCR معکوس دو مرحله ای، نمونه RNA در یک واکنش جداگانه در حضور آنزیم ترانسکرپیتاز معکوس به cDNA تبدیل شده و سپس این نمونه به عنوان تمپلیت برای مرحله PCR استفاده می شود.
در چه مواردی از one-step RT-PCR استفاده نمیکنیم ؟
در مواردی که بخواهیم چند هدف متفاوت را بر یک نمونه cDNA بررسی کنیم، بهتر است ابتدا یک واکنش RT-PCR انجام داده و سپس برای هر واکنش PCR مقدار کمی از cDNA را به عنوان تمپلیت استفاده میکنیم.
علاوه بر این در مواردی که نیاز است cDNA ما برای استفاده‌های بعدی ذخیره سازی شود، استفاده از روش تک مرحله ای امکان پذیر نیست.
علاوه بر این در واکنش تک مرحله‌ای محدودیت‌هایی در انتخاب نوع آنزیم ریورس ترانسکریپتاز و پلیمراز وجود دارد و به همین دلیل برای نمونه‌های کم و یا نمونه‌هایی که به سختی PCR می‌شوند همچنان روش دو مرحله‌ای پیشنهاد میشود.
استفاده از روش تک مرحله ای در ریل تایم PCR:
یکی از انواع پر کاربرد مستر میکس PCR تک مرحله ای، مستر میکس‌های ریل تایم تک مرحله‌ای هستند. از آنجایی که ریل تایم PCR یکی از پرکاربردترین ابزار در تشخیص مولکولی در آزمایشگاه‌های تشخیصی است و این آزمایشگاه‌ها عموما به مواردی چون تکرار پذیری، سرعت آزمایش، سادگی و پیپتاژ کم و خطای پایین نیازمند هستند، بیشتر آزمایشات مولکولی آزمایشگاه‌های تشخیصی با استفاده از این نوع از مسترمیکس انجام میشود.
به همین دلیل اغلب کیت‌های تشخیصی ریل تایم PCR بر مبنای روش One-Step Real-Time RT-PCR طراحی شده اند.
یکی از انواع پر کاربرد مستر میکس PCR تک مرحله ای، مستر میکس‌های ریل تایم تک مرحله‌ای هستند. از آنجایی که ریل تایم PCR یکی از پرکاربردترین ابزار در تشخیص مولکولی در آزمایشگاه‌های تشخیصی است و این آزمایشگاه‌ها عموما به مواردی چون تکرار پذییری، سرعت آزمایش، سادگی و پیپتاژ کم و خطای پایین نیازمند هستند، بیشتر آزمایشات مولکولی آزمایشگاه‌های تشخیصی با استفاده از این نوع از مسترمیکس انجام میشود.
به همین دلیل اغلب کیت‌های تشخیصی ریل تایم PCR بر مبنای روش One-Step Real-Time RT-PCR طراحی شده اند.
منبع :
https://www.anacelltec.com/one-step-rt-pcr-vs-two-step-rt-pcr/